Что такое ПЦР-анализ?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — это точный метод лабораторной диагностики, который используют для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. В 1983 году его открыл американский ученый Кэри Мюллис, за что впоследствии и получил Нобелевскую премию. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев перспективность и эффективность, его стали продвигать в практическую медицину.

Что представляет собой ПЦР

Анализ абсолютно специфичен. При правильном выполнении он не может дать ложноположительный результат, поэтому его используют для диагностики инфекционных и наследственных заболеваний, для установления отцовства, клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов. В основу положена возможность значительно увеличивать малые концентрации определенных фрагментов ДНК. Для исследования потребуется небольшое количество биоматериала, например крови, слюны или мазок из половых органов. Анализ проводят в искусственных условиях (in vitro).

ДНК содержит генетическую информацию любого живого организма. Молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Например, вирус COVID-19 хранит свой код в РНК — одной нити нуклеотидов. Их последовательность уникальна для каждого организма, как отпечаток пальца или скан сетчатки глаза. Поскольку для каждого возбудителя зарегистрированы типичные укороченные последовательности нуклеотидов, то они хранятся в лабораториях в виде праймеров. Их в свою очередь присоединяют к ДНК возбудителя в пробе, и они многократно воспроизводят свои дубли под действием катализаторов. Многократное увеличение происходит до тех пор, пока участок не станет доступным для определения и только при наличии в биоматериале ДНК патогена.

Преимущества ПЦР-диагностики

Заслуженная популярность метода заключается в простом исполнении, показателях чувствительности и специфичности. Описать ПЦР-анализ можно всего тремя словами — точность, надежность, скорость. К основным достоинствам исследования относят:

1. Специфичность, которая достигает 100%. При анализе выделяют фрагмент ДНК, присущий конкретному возбудителю. Уникальность участка позволяет в одном и том же материале находить одновременно нескольких возбудителей без ущерба качеству.
2. Суперчувствительность. Для исследования достаточно несколько молекул ДНК активного или даже уже разрушенного патогена, но который оставил специфические участки. Метод выявляет одну болезнетворную бактерию среди миллиардов других, при этом он эффективен там, где бессильны другие виды исследований — микроскопический, бактериологический, иммуноферментный.
3. Скорость. Не требуется искусственно выращивать возбудитель. На постановку реакции нужно всего лишь несколько часов, то есть результат можно получить в течение дня.
4. Диагностику заболевания в инкубационном периоде. Анализ определяет возбудителя, а не реакцию организма на него. Выходит, что можно поставить точный диагноз, когда болезнь еще никак себя не проявила.
5. Универсальность. Для анализа подходит большинство разновидностей биоматериала — слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток, гной, жидкости из абсцессов.

Особенности применения ПЦР-теста

Метод используют везде, где нужен быстрый, точный и надежный результат. Возбудители многих инфекций имеют несколько штаммов, поэтому точная диагностика гарантирует и эффективность лечения. Анализ проверен временем, тщательно апробирован клинически, поэтому его часто назначают в качестве дополнительного обследования, чтобы выявить определенный тип вируса или микроба. Кроме медицины метод нашел применение в генетике, криминалистике, археологии.

ПЦР-диагностика играет ведущую роль в выявлении неврологических и урологических заболеваний. Использование передовых технологий позволяет:

• определить причины острых уретритов — берут соскоб клеток из мочеиспускательного каналы у мужчины или женщины, влагалища, цервикального канала;
• диагностировать циститы, особенно хронические — через мочу или соскоб из шейки мочевого пузыря;
• тщательно обследовать простатит — берется секрет простаты;
• определить воспалительные заболевания головки полового члена и крайней плоти — соскоб клеток высыпаний;
• диагностировать ряд кожных патологий.

В гинекологии ПЦР-анализы — обязательная диагностическая процедура, входящая в профиль обследований различных женских патологий. В первую очередь это диагностика широкого спектра заболеваний, передающихся половым путем. Врач может назначить анализ при подозрении на хламидиоз, гонорею, герпес, вирусы папилломы человека. В качестве биоматериала обычно выступают кровь, моча или вагинальный соскоб.

Метод ПЦР — наиболее точный способ выявления Covid-19. Его преимущество в том, что он обнаруживает сам вирус. По данным исследований, клиническая чувствительность тестов составляет около 80%, поэтому получение ложноотрицательного или ложноположительного результата сведено к минимуму.

Подтвердить патогенного агента удастся даже при бессимптомном течении заболевания. И, наоборот, диагностика не даст положительного результата, если много антител, а самого вируса уже нет. Для проведения теста у вас возьмут образец слизи из носа или горла. Тампон на несколько секунд оставляют на слизистой, потом поворачивают и с небольшим нажимом извлекают, далее герметично упаковывают в пробирку и отправляют на анализ.

Как протекает ПЦР

Для простейшего случая потребуются следующие составляющие:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
• два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
• термостабильная ДНК-полимераза;
• дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
• ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
• буферный раствор.

Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории обычно включает:

• амплификатор (термоциклер);
• систему для гель-электрофореза с источником питания — для визуализации результатов ПЦР;
• систему гель-документации — для анализа результатов;
• ПЦР-бокс — для пробоподготовки;
• вортекс;
• микроцентрифуги;
• набор автоматических дозаторов — механических или электронных;
• стерильные наконечники;
• пробирки и штативы для них и дозаторов.

Взятый у пациента биоматериал может содержать фрагменты ДНК или РНК инфекционного возбудителя, однако его обычно крайне мало для определения принадлежности микроорганизма к какому-либо из видов. Вот тут на помощь и приходит полимеразная цепная реакция. Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой, но чтобы он заработал, понадобится два праймера — прямой и обратный, длина которых обычно не более 20 нуклеотидов.

Фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. За 25–35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК. В этом и заключается суть ПЦР: берут малое количество ДНК или РНК-содержащего материала для исследования, а реакция способствует увеличению количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю, поэтому становится возможным его идентификация.

Этапы реакции

Среди них можно выделить:

1. Денатурацию. ДНК нагревается до 94–95°С, в результате чего образуются две однонитевые молекулы.
2. Отжиг, или присоединение праймеров. Температуру снижают до 37–55°С, праймеры присоединяются к комплементарным по строению участкам ДНК.
3. Синтез ДНК. Температуру повышают до 72°С в присутствии фермента — термоустойчивой ДНК-полимеразы, в результате чего к каждой из исходных нитей ДНК достраивается вторая (новая) нить ДНК по принципу комплементарности, синтез которой и запустили праймеры.

Количество ДНК увеличивается экспоненциально, и итоговое ее количество составляет 2n, где n равно числу циклов. После 30 циклов количество копий исследуемого гена может быть увеличено более чем в 1 млн раз.

Подготовка биоматериала к ПЦР-тесту и его транспортировка

К различным ошибкам могут приводить как отсутствие опыта в использовании данной методики, так и стереотипы мышления персонала, ранее работавшего в биохимических или бактериологических лабораториях, где иные требования к работе. В результате таких ошибок могут быть получены ложноположительные, ложноотрицательные или недостоверные результаты анализов. Для получения достоверных данных требуется учитывать ряд факторов:

• состояние пациента, основные — пол, возраст, диагноз;
• свойства биологического материала;
• условия взятия, времени хранения и транспортировки.

В лаборатории медицинского центра «Чудо Доктор» строго соблюдают все этапы ПЦР-анализа: от забора биоматериала до интерпретации полученных результатов. Например, мы используем вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом. При ПЦР применяют только одноразовые инструменты и пробирки одноразового использования с транспортной средой.

Метод исключает субъективизм человеческого фактора при оценке результатов реакции, поскольку она протекает в автоматическом режиме. Реакционная пробирка в процессе проведения анализа остается герметично закрытой, что исключает контаминацию и выдачу ложноположительных результатов. Само исследование проходит быстро: в большинстве случаев уже на следующий день вы можете забрать результаты.

Обратите внимание! Материал предложен в ознакомительных целях. Информацию нельзя использовать в качестве самодиагностики и самолечения. Если вы чувствуете боль, или случилось обострение какой-либо патологии, запишитесь на прием к врачу. Только специалист может назначить вам диагностическое исследование, поставить диагноз и определить компетентное лечение.